مولېكۇلا دىئاگنوزى ، ئادەتتە ئىشلىتىلىدىغان PCR تېخنىكىسى ۋە پرىنسىپى

PCR، پولىمېرازا زەنجىرسىمان ئىنكاسى بولۇپ ، ئۇ DNA پولىمېراسىنىڭ كاتالىزاتورى ئاستىدا سىستېمىغا DNTP ، Mg2 + ، ئۇزارتىش ئامىلى ۋە كۈچەيتمە كۈچەيتىش ئامىلىنىڭ قوشۇلۇشىنى كۆرسىتىدۇ ، ئانا DNA نى قېلىپ قىلىپ ، كونكرېت ئىپتىدائىي كېڭەيتىشنىڭ باشلىنىش نۇقتىسى قىلىدۇ. ئايرىش ، ئۇلاش ، كېڭەيتىش قاتارلىق باسقۇچلار ئارقىلىق ، ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىش جەريانىدىكى قىزلارنىڭ تاياقچە DNA نى ئاتا-ئانىلار قېپى قېلىپىنى تولۇقلاش جەريانى ۋىرۇستىكى ھەر قانداق نىشان DNA نى تېز ۋە ئالاھىدە كۈچەيتەلەيدۇ.

1. قىزىق باشلاش PCR

ئادەتتىكى PCR دا كۈچەيتىشنىڭ باشلىنىش ۋاقتى PCR ماشىنىسىنى PCR ماشىنىسىغا سالماسلىق ، ئاندىن پروگرامما كېڭەيتىشكە باشلايدۇ.سىستېما سەپلىمىسى تاماملانغاندىن كېيىن ، كېڭەيتىش باشلىنىدۇ ، بۇ بەلكىم ئالاھىدە كۈچەيتمەسلىكنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن ، قىزىق قوزغىتىش PCR بۇ مەسىلىنى ھەل قىلالايدۇ.

قىزىق باشلىنىش PCR دېگەن نېمە؟رېئاكسىيە سىستېمىسى تەييارلانغاندىن كېيىن ، فېرمېنت ئۆزگەرتكۈچ يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا (ئادەتتە 90 سېلسىيە گرادۇستىن يۇقىرى) قويۇپ بېرىلىدۇ ياكى ئىنكاسنىڭ دەسلەپكى قىزىتىش باسقۇچىدا ياكى «ئىسسىق باشلىنىش» باسقۇچىدا قويۇپ بېرىلىپ ، DNA پولىمېراسى ئاكتىپلىنىدۇ.ئېنىق قوزغىتىش ۋاقتى ۋە تېمپېراتۇرىسى DNA پولىمېراسىنىڭ خاراكتېرى ۋە قىزىق قوزغىتىش ئۆزگەرتكۈچنىڭ خاراكتېرىگە باغلىق.بۇ ئۇسۇل ئاساسلىقى ئانتىتېلا ، يېقىنلىق پەردىسى ياكى خىمىيىلىك ئۆزگەرتكۈچ قاتارلىق ئۆزگەرتكۈچلەرنى ئىشلىتىپ ، DNA پولىمېراسىنىڭ پائالىيىتىنى چەكلەيدۇ.ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا DNA پولىمېراسىنىڭ پائالىيىتى توسقۇنلۇققا ئۇچرىغانلىقتىن ، ئىسسىق باشلاش تېخنىكىسى PCR ئىنكاسىنىڭ ئالاھىدىلىكىنى قۇربان قىلماي ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا كۆپ خىل PCR ئىنكاس سىستېمىسى تەييارلاشقا ناھايىتى قۇلايلىق يارىتىپ بېرىدۇ.

2. RT-PCR

RT-PCR (تەتۈر ترانسكرىپسىيە PCR) mRNA دىن cDNA غا تەتۈر كۆچۈرۈش ۋە ئۇنى كېڭەيتىشنىڭ قېلىپى سۈپىتىدە ئىشلىتىشنىڭ تەجرىبە تېخنىكىسى.تەجرىبە جەريانى ئالدى بىلەن توقۇلمىلار ياكى ھۈجەيرىلەردىكى RNA نى چىقىرىش ، Oligo (dT) نى دەسلەپكى قەدەمدە ئىشلىتىش ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئارقىلىق cDNA نى بىرىكتۈرۈش ، ئاندىن cDNA نى PCR كېڭەيتىشنىڭ قېلىپى قىلىپ ، نىشانلىق گېنغا ئېرىشىش ياكى گېننىڭ ئىپادىسىنى بايقاش.

3. فلۇئورېسسېنسىيىلىك مىقدار PCR

فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR (ھەقىقىي ۋاقىتتىكى PCR ،RT-qPCR) PCR رېئاكسىيە سىستېمىسىغا فلۇئورېسسېنسىيە گۇرۇپپىسىنى قوشۇش ، فلۇئورېسسېنسىيە سىگنالىنىڭ توپلىنىشىدىن پايدىلىنىپ پۈتكۈل PCR جەريانىنى دەل ۋاقتىدا نازارەت قىلىش ، ئاخىرىدا ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ئارقىلىق قېلىپنى مىقدارلاشتۇرۇپ تەھلىل قىلىش ئۇسۇلىنى كۆرسىتىدۇ.كۆپ ئىشلىتىلىدىغان qPCR ئۇسۇللىرى SYBR Green I ۋە TaqMan نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.

4. Nested PCR

Nested PCR دېگىنىمىز ئىككى يۈرۈش PCR كۈچەيتكۈچكە ئىككى يۈرۈش PCR پىرىسلىغۇچ ئىشلىتىشنى كۆرسىتىدۇ ، ئىككىنچى ئايلانمىنىڭ كۈچەيتمە مەھسۇلاتى نىشان گېن پارچىسى.

ئەگەر بىرىنچى جۈپ پىرىمېر (تاشقى پىرىمېر) ماس كەلمىسە ، ئالاھىدە بولمىغان مەھسۇلاتنىڭ كۈچىيىشىنى كەلتۈرۈپ چىقارسا ، ئوخشاش بولمىغان رايوننىڭ ئىككىنچى جۈپ پىرىمېر تەرىپىدىن ئېتىراپ قىلىنىشى ۋە داۋاملىق كۈچەيتىلىشى مۇمكىنچىلىكى ئىنتايىن كىچىك ، شۇڭا ئىككىنچى جۈپ پىرىسلاش ئارقىلىق كۈچەيتىلگەن ، PCR نىڭ ئالاھىدىلىكى يۇقىرى كۆتۈرۈلگەن.PCR نىڭ ئىككى ئايلانمىسىنى ئىجرا قىلىشنىڭ بىر ئارتۇقچىلىقى شۇكى ، ئۇ چەكلىك بولغان DNA دىن يېتەرلىك مەھسۇلاتنى ئاشۇرۇشقا ياردەم بېرىدۇ.

5. Touchdown PCR

Touchdown PCR بولسا PCR دەۋرىيلىك پارامېتىرلىرىنى تەڭشەش ئارقىلىق PCR ئىنكاسىنىڭ خاسلىقىنى يۇقىرى كۆتۈرۈشنىڭ ئۇسۇلى.

چەكمە كونتىروللۇق PCR دا ، ئالدىنقى بىر نەچچە دەۋرىيلىكنىڭ تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى پىرىمېرلارنىڭ ئەڭ يۇقىرى تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى (Tm) دىن بىر نەچچە گرادۇس يۇقىرى ئورۇنغا قويۇلغان.يۇقىرى تېمپېراتۇرىنىڭ تېمپېراتۇرىسى ئالاھىدە بولمىغان كۈچەيتكۈچنى ئۈنۈملۈك تۆۋەنلىتىدۇ ، ئەمما شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا ، تېخىمۇ يۇقىرى تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى ئىپتىدائىي ۋە نىشان تەرتىپىنى ئايرىشنى ئېغىرلاشتۇرۇۋېتىدۇ ، نەتىجىدە PCR مەھسۇلات مىقدارى تۆۋەنلەيدۇ.شۇڭلاشقا ، ئالدىنقى بىر قانچە دەۋرىيلىكتە ، تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى ئادەتتە ھەر بىر دەۋرىيلىكتە ° C1 تۆۋەنلەپ ، سىستېمىدىكى نىشان گېننىڭ مىقدارىنى ئاشۇرىدۇ.ياندۇرۇش تېمپېراتۇرىسى ئەڭ ياخشى تېمپېراتۇرىغا چۈشۈرۈلگەندە ، قالغان دەۋرىيلىكلەرنىڭ تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى ساقلىنىدۇ.

6. بىۋاسىتە PCR

بىۋاسىتە PCR نىشاندىكى DNA نىڭ كۆپەيتىلىشىنى كۆرسىتىدۇ ، يادرو كىسلاتاسىنى ئايرىۋېتىش ۋە تازىلاشنىڭ ھاجىتى يوق.

بىۋاسىتە PCR نىڭ ئىككى خىل شەكلى بار:

بىۋاسىتە ئۇسۇل: ئازراق ئەۋرىشكە ئېلىپ PCR پەرقلەندۈرۈش ئۈچۈن بىۋاسىتە PCR Master Mix غا قوشۇڭ.

يېرىلىش ئۇسۇلى: ئەۋرىشكىنى ئەۋرىشكە ئېلىپ بولغاندىن كېيىن ، ئۇنى لىزاتقا قوشۇپ ، گېننى قويۇپ بېرىڭ ، ئاز مىقداردا لەيلىمە خاسىيەتلىك ماددا ئېلىپ PCR Master Mix غا قوشۇڭ ، PCR پەرقلەندۈرۈشنى قىلىڭ.بۇ خىل ئۇسۇل تەجرىبە ئىشلەش جەريانىنى ئاددىيلاشتۇرىدۇ ، ۋاقىتنى قىسقارتىدۇ ۋە تازىلاش باسقۇچىدا DNA يوقىتىشتىن ساقلىنىدۇ.

7. SOE PCR

PCR (SOE PCR) بىر-بىرىنى تولۇقلاپ كېڭەيتىش ئارقىلىق گېننى كۆپەيتىش ئارقىلىق PCR مەھسۇلاتلىرىنى قاپلاش زەنجىرىنى ھاسىل قىلىدۇ ، شۇڭا كېيىنكى كۈچەيتىش ئىنكاسىدا ، قاپلانغان زەنجىرنى كېڭەيتىش ئارقىلىق ، كۈچەيتىلگەن پارچىلار قاپلانغان تېخنىكىنىڭ ئوخشىمىغان مەنبەلىرى. ھەمدە بىللە چاپلىدى.بۇ تېخنىكىنىڭ ھازىر ئىككى ئاساسلىق قوللىنىش يۆنىلىشى بار: بىرىكتۈرۈش گېنى قۇرۇشگېن بېكەتكە يۈزلەنگەن ئۆزگىرىش.

8. IPCR

تەتۈر PCR (IPCR) تەتۈر تولۇقلىما پىرىس ئىشلىتىپ ، ئىككى پىرىستىن باشقا DNA پارچىلىرىنى كۈچەيتىدۇ ، ھەمدە مەلۇم بىر DNA پارچىسىنىڭ ئىككى تەرىپىدىكى نامەلۇم تەرتىپلەرنى كۈچەيتىدۇ.

IPCR ئەسلىدە قوشنا نامەلۇم رايونلارنىڭ تەرتىپىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن لايىھەلەنگەن بولۇپ ، كۆپىنچە گېننى ئىلگىرى سۈرۈش تەرتىپىنى تەتقىق قىلىشقا ئىشلىتىلىدۇ.گېننىڭ بىرىكىشى ، يۆتكىلىشى ۋە يۆتكىلىشى قاتارلىق ئونكوگېنلىق خروموسومنىڭ قايتا تەشكىللىنىشى.ۋىرۇسلۇق گېننىڭ بىرىكىشى ، ھازىرمۇ كۆپ ئىشلىتىلىدۇ.

9. dPCR

رەقەملىك PCR (dPCR) يادرو كىسلاتا مولېكۇلاسىنى مۇتلەق مىقدارلاشتۇرۇشتىكى تېخنىكا.

ھازىر يادرو كىسلاتا مولېكۇلاسىنى مىقدارلاشتۇرۇشنىڭ ئۈچ خىل ئۇسۇلى بار.فوتومېتىرىيە يادرو كىسلاتا مولېكۇلاسىنىڭ سۈمۈرۈلۈشىنى ئاساس قىلىدۇ.ھەقىقىي ۋاقىتتىكى فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR (Real Time PCR) Ct قىممىتىنى ئاساس قىلىدۇ ، Ct قىممىتى بايقىغىلى بولىدىغان فلۇئورېسسېنسىيە قىممىتىگە ماس كېلىدىغان دەۋرىيلىك ساننى كۆرسىتىدۇ.رەقەملىك PCR يەككە مولېكۇلا PCR ئۇسۇلىنى ئاساس قىلغان ئەڭ يېڭى مىقدار تېخنىكىسى بولۇپ ، يادرو كىسلاتاسىنى مىقدارلاشتۇرۇش مۇتلەق مىقدارلاشتۇرۇش ئۇسۇلى.